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计算 PCR 引物解链温度 Tm，同时给出两种方法：Wallace 规则 Tm = 2°C×(A+T) + 4°C×(G+C)（适用于 <14 nt 短链的快速估算，忽略序列上下文、浓度与盐）与 SantaLucia 1998 统一最近邻热力学法 Tm = 1000ΔH/(ΔS + R·ln(Ct/4) + 0.368(N−1)·ln[Na+]) − 273.15（含 16 种二核苷酸堆积参数、末端起始项与自互补对称校正，Primer3 同源方法，可设引物浓度与钠离子浓度）。另输出 GC 含量、碱基组成与推荐退火温度 Tm−5°C。来源：Wallace 1979、SantaLucia PNAS 1998、Breslauer 1986、Primer3 2012。仅供引物初筛，请以试剂商计算器复核。
执行
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案例
相关内容
工具使用指南
PCR 引物 Tm 计算器支持 Wallace 规则和 SantaLucia 1998 最近邻法，输入 5'→3' 方向的 A/C/G/T DNA 引物序列后，可获得解链温度、GC 含量、碱基组成及 Tm−5°C 的推荐退火温度起点。结果仅适用于引物初筛，实验前请使用试剂商计算器复核。
背景
实验人员需要评估经典 M13 正向引物 GTAAAACGACGGCCAGT 的 PCR 适用温度。
问题
确认 Wallace 快速估算与最近邻法结果是否接近，并获得退火温度起点。
如何使用
输入序列 GTAAAACGACGGCCAGT，选择最近邻法，并保留 500 nM 引物浓度、50 mM 钠离子浓度和 1 位小数。
序列：GTAAAACGACGGCCAGT；方法：最近邻法；引物浓度：500 nM；钠离子浓度：50 mM；小数位数：1。结果
序列长度为 17 nt，GC 含量为 52.94%；Wallace Tm 为 52°C，最近邻 Tm 为 52.8°C，推荐退火温度起点约为 47.8°C。
背景
方法开发人员正在评估短序列 ACGTACGTACGT，并希望了解简单规则与热力学模型的差异。
问题
Wallace 规则可能无法充分体现交替序列中的二核苷酸堆积稳定性。
如何使用
输入 ACGTACGTACGT，选择 Wallace 规则，并设置 250 nM 引物浓度、100 mM 钠离子浓度进行结果对比。
序列：ACGTACGTACGT；方法：Wallace 规则；引物浓度：250 nM；钠离子浓度：100 mM；小数位数：1。结果
序列长度为 12 nt，GC 含量为 50%；Wallace Tm 为 36°C，最近邻 Tm 为 42.6°C，推荐退火温度起点约为 31°C。
支持 5'→3' 方向、仅含 A/C/G/T 的 DNA 序列，长度为 5–60 nt，大小写均可。
Wallace 规则按 A/T 和 G/C 数量快速估算；最近邻法还考虑二核苷酸堆积、末端项、盐浓度和引物浓度。
这两个参数仅用于最近邻法；Wallace 规则不使用浓度或盐浓度。
工具提供 Tm−5°C 的推荐退火温度起点，不代表最终实验条件。
结果仅供引物初筛，实际 PCR 条件还应结合试剂体系，并使用试剂商计算器复核。