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计算 PCR 退火温度 Ta，支持两条规则：实验台默认的简单规则 Ta = Tm − 5°C（取引物对中较低的 Tm），与 Rychlik 1990 经验公式 Ta = 0.3×Tm(引物) + 0.7×Tm(产物) − 14.9（产物 Tm 通常 75–90°C，对典型引物对比简单规则高 1–8°C）。输出推荐 Ta、±3°C 梯度范围以及调温方向指引：温度过低出现非特异带与引物二聚体，过高则无扩增；两条引物 Tm 差应控制在 2–3°C 内并按较低者退火。来源：Rychlik 1990、Innis & Gelfand 1990、Lorenz 2012。仅供实验规划。
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案例
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工具使用指南
PCR 退火温度计算器根据两条引物的 Tm 计算推荐退火温度 Ta：可选择简单规则（较低引物 Tm − 5°C）或 Rychlik 1990 公式，并输出 ±3°C 梯度范围及温度调整参考，仅供实验规划使用。
背景
正向引物 Tm 为 62°C，反向引物 Tm 为 60°C，产物 Tm 为 85°C。
问题
需要快速确定简单规则下的 PCR 初始退火温度和梯度范围。
如何使用
选择“简单规则（Tm − 5°C）”，输入正向 Tm 62、反向 Tm 60 和产物 Tm 85，并保留 1 位小数。
rule=simple；forwardTm=62；reverseTm=60；productTm=85；decimalPlaces=1结果
推荐 Ta 为 55°C，梯度范围为 52–58°C；两条引物 Tm 相差 2°C，处于建议范围内。
背景
同一引物对的正向引物 Tm 为 62°C、反向引物 Tm 为 60°C，产物 Tm 为 85°C。
问题
希望用产物 Tm 参与计算，获得与简单规则不同的退火温度参考。
如何使用
选择“Rychlik 公式（1990）”，输入两条引物 Tm 和产物 Tm。
rule=rychlik；forwardTm=62；reverseTm=60；productTm=85；decimalPlaces=1结果
推荐 Ta 为 62.6°C，梯度范围为 59.6–65.6°C；该结果比简单规则的 55°C 高约 7.6°C，可作为梯度测试参考。
使用正向和反向引物中较低的 Tm，再减去 5°C。
需要两条引物的 Tm 和 PCR 产物的 Tm。
Rychlik 公式会将引物 Tm 和产物 Tm 一起纳入计算，产物 Tm 通常约为 75–90°C。
工具以推荐 Ta 为中心，输出上下各 3°C 的范围。
建议控制在 2–3°C 内，并按较低的引物 Tm 设定退火温度。
背景
准备使用一对 Tm 分别为 66°C 和 61°C 的引物进行 PCR。
问题
需要在设定退火温度前确认两条引物的 Tm 是否接近。
如何使用
输入正向引物 Tm 66°C、反向引物 Tm 61°C，并选择简单规则查看 Ta 和引物差值提示。
rule=simple；forwardTm=66；reverseTm=61；productTm=85；decimalPlaces=1结果
工具按较低 Tm 计算推荐 Ta 为 56°C，并显示两条引物 Tm 相差 5°C；该差值超过建议的 2–3°C 范围，应谨慎评估引物组合。