Welche Eingaben benötigt der Rechner?

Sie benötigen die Proteinkonzentration, die Temperatur und entweder den gebundenen Anteil oder die Anisotropiewerte für freien, gebundenen und gemessenen Zustand.

Kd ist die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante. Kleinere Kd-Werte stehen für eine stärkere Protein-DNA-Bindung.

Wann sollte ich den Anisotropiemodus verwenden?

Verwenden Sie ihn, wenn eine gemessene Anisotropie sowie Referenzwerte für die freie und vollständig gebundene DNA vorliegen.

Welche Annahmen verwendet die Berechnung?

Sie basiert auf Gleichgewicht, einem 1:1-Bindungsmodell und einem großen Überschuss an Protein gegenüber markierter DNA.

Ist der Rechner für vollständige Titrationskurven geeignet?

Er schätzt Kd aus einem einzelnen Messpunkt. Für vollständige Titrationen sollte die gesamte Kurve angepasst werden.

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Protein-DNA-Bindungsaffinitätsrechner (Kd-Schätzung)

Schätzt das Kd aus einem Messpunkt gemäß 1:1-Gleichgewicht: bei Proteinüberschuss gilt f = [P]÷([P]+Kd), also Kd = [P]×(1−f)÷f; bei f = 0,5 entspricht das Kd der Proteinkonzentration. Zwei Eingaben: gebundener Anteil direkt (0–1) oder Fluoreszenzanisotropie f = (r−rfrei)÷(rgeb.−rfrei). Ergänzt ΔG° = RT·ln(Kd) (standardmäßig 25 °C). Bereiche: <1 nM sehr fest, 1–100 nM fest (typische Ziele von Transkriptionsfaktoren), 100 nM–1 µM mäßig, >1 µM schwach (Salz und poly(dI-dC)-Wettbewerber prüfen). Annahmen: Gleichgewicht, 1:1, Protein im großen Überschuss; für vollständige Kurven die gesamte Titration fitten. Quellen: Cantor & Schimmel, Heyduk & Lee 1990, Lakowicz. Nur für Ausbildung.

Ausführung

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2 Beispiele

f = 0,5 bei 50 nM Protein → Kd = 50 nM, ΔG° = −9,96 kcal/mol

Ein EMSA- oder Anisotropiepunkt bei 50 nM Protein zeigt die Hälfte der markierten DNA gebunden. Da f = 0,5, gilt direkt Kd = [P] = 50 nM — eine feste sequenzspezifische Wechselwirkung. Bei 25 °C entspricht das ΔG° = RT·ln(5×10⁻⁸ M) ≈ −9,96 kcal/mol, klar im Bereich guter Transkriptionsfaktor-Zielsites.

{"result":"Kd ≈ 50 nM (fraction bound 0.5 at 50 nM protein); ΔG° = −9.96 kcal/mol at 25 °C.","metadata":{"input":{"mode":"fraction","proteinConcNm":50,"fractionBound":0.5,"temperatureC":25},"result":{"kdNm":50,"fractionBound":0.5,"deltaGKcalMol":-9.96}}}

Anisotropie 0,18 zwischen 0,12/0,25 → f = 0,46, Kd = 23,33 nM

Ein Fluoreszein-markiertes Oligo liefert r_frei = 0,12 allein und r_geb. = 0,25 bei Proteinsättigung. Eine Probe mit 20 nM Protein liest r = 0,18, also f = (0,18−0,12)/(0,25−0,12) = 0,46 und Kd = 20 × 0,54/0,46 = 23,33 nM (ΔG° = −10,41 kcal/mol bei 25 °C). Das Beispiel zeigt die Algebra des Anisotropiemodus und den Praxistipp, r_frei und r_geb. im selben Puffer zu messen.

{"result":"Kd ≈ 23.33 nM (fraction bound 0.46 from anisotropy 0.18); ΔG° = −10.41 kcal/mol.","metadata":{"input":{"mode":"anisotropy","proteinConcNm":20,"anisotropy":0.18,"anisotropyFree":0.12,"anisotropyBound":0.25},"result":{"kdNm":23.33,"fractionBound":0.46,"deltaGKcalMol":-10.41}}}

Eingaben

Fülle die erforderlichen Felder aus und starte das Tool.

8 Optionen

EinstellungenFormate, Bereiche, Zahlen und Modi anpassen.8

BerechnungsmodusselectPflichtEnter the bound fraction directly, or derive it from anisotropy values.Proteinkonzentration (nM)numberPflichtTotal protein concentration in the binding reaction (kept well above the labeled DNA).Gebundener Anteil (0–1)numberPflichtFraction of labeled DNA in complex (fraction mode; strictly between 0 and 1).Gemessene Anisotropie (r)numberPflichtAnisotropy of the sample (anisotropy mode).Anisotropie des freien Zustands (r frei)numberPflichtAnisotropy of the unbound labeled DNA alone.Anisotropie des gebundenen Zustands (r geb.)numberPflichtAnisotropy of the fully bound complex (protein-saturated).Temperatur (°C)numberPflichtIncubation temperature, used for ΔG° = RT·ln(Kd).DezimalstellennumberOptionales Feld

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1. Gebundener Anteil von 0,5 bei 50 nM Protein

2. Kd-Schätzung aus Fluoreszenzanisotropie

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