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按 NEB 规范设定连接反应：pmol = ng × 10³ ÷ (650 × bp)。求插入片段质量模式用经典公式 插入 ng = 比例 × 载体 ng × (插入 bp ÷ 载体 bp)（650 系数相消，纯 bp 换算）；核对模式输入两者质量得实际摩尔比。按插入片段长度给出建议区间：<200 bp 用 5–10:1，200–999 bp 用 3–5:1，≥1000 bp 用 1–5:1，并提示比例过高（>10:1）反而促成插入片段自连/多拷贝。输入反应体积可得载体/插入 nM 浓度（连接酶对末端浓度敏感，>1 nM 更高效）。来源：NEB NEBioCalculator 与连接指南、Promega BioMath、Sambrook & Russell。仅供教学与实验规划。
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案例
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工具使用指南
连接反应摩尔比计算器可根据载体与插入片段的大小、质量和目标插入:载体比例，计算所需插入片段质量，或核对实际摩尔比；输入反应体积后，还可估算两者的 nM 浓度。结果依据 pmol = ng × 10³ ÷ (650 × bp)，仅供教学与实验规划参考。
背景
实验计划使用 3000 bp 载体和 1000 bp 插入片段，载体质量为 100 ng，目标插入:载体摩尔比为 3:1，反应体积为 20 µL。
问题
需要确定应加入多少插入片段，并查看连接反应中的 DNA 浓度。
如何使用
选择“求插入片段质量”，输入载体大小 3000 bp、载体质量 100 ng、插入片段大小 1000 bp、目标比例 3，以及反应体积 20 µL。
mode：求插入片段质量；vectorSizeBp：3000；vectorMassNg：100；insertSizeBp：1000；ratio：3；reactionVolumeUl：20。结果
需要加入 100 ng 插入片段；载体约为 0.051 pmol，插入片段约为 0.154 pmol，实际比例为 3:1。20 µL 反应中，载体约 2.564 nM，插入片段约 7.692 nM。
背景
已有 4000 bp 载体 200 ng 和 750 bp 插入片段 30 ng，需要在连接前检查两者的实际摩尔比。
问题
判断现有插入片段用量是否达到 750 bp 片段建议的 3–5:1 区间。
如何使用
选择“核对实际比例”，输入载体大小 4000 bp、载体质量 200 ng、插入片段大小 750 bp、插入片段质量 30 ng。
mode：核对实际比例；vectorSizeBp：4000；vectorMassNg：200；insertSizeBp：750；insertMassNg：30。结果
插入片段 ng = 目标比例 × 载体 ng ×（插入片段 bp ÷ 载体 bp）。
小于 200 bp 通常为 5–10:1，200–999 bp 为 3–5:1，1000 bp 及以上为 1–5:1。
需要输入载体大小、载体质量、插入片段大小和插入片段质量，目标比例在核对模式下不参与实际比例计算。
可以。将反应体积设为 0 即可跳过 nM 浓度计算，工具仍会计算质量、pmol 和摩尔比。
不一定。比例过高可能促进插入片段自连或形成多拷贝连接产物，工具会对此进行提示。
载体约为 0.08 pmol，插入片段约为 0.06 pmol，实际比例约为 0.8:1，低于 750 bp 插入片段建议的 3–5:1 区间。