Berechnet die PCR-Annealing-Temperatur (Ta) nach zwei Regeln: die einfache Laborregel Ta = Tm − 5°C (mit dem KLEINEREN Tm des Primerpaares) und die empirische Formel von Rychlik 1990: Ta = 0.3×Tm(Primer) + 0.7×Tm(Produkt) − 14.9 (Produkt-Tm typisch 75–90°C; die Formel liegt bei typischen Paaren 1–8°C über der einfachen Regel). Liefert die empfohlene Ta, einen ±3°C-Gradientenbereich und die Richtung der Justage: zu niedrige Ta gibt unspezifische Banden und Primerdimere, zu hohe kein Produkt; halten Sie die Primer-Tm-Werte innerhalb von 2–3°C und annealen Sie nach dem kleineren. Quellen: Rychlik 1990, Innis & Gelfand 1990, Lorenz 2012. Nur für die Versuchsplanung.
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Wichtige Fakten
Kategorie
Education
Eingabetypen
select, number
Ausgabetyp
json
Sample-Abdeckung
4
API bereit
Ja
Überblick
Der PCR-Annealing-Temperatur-Rechner bestimmt die empfohlene Annealing-Temperatur Ta aus den Tm-Werten eines Primerpaares. Zur Auswahl stehen die einfache Regel Ta = kleinerer Tm − 5 °C und die Rychlik-Formel von 1990; zusätzlich wird ein Gradientenbereich von ±3 °C ausgegeben.
Wann verwenden
Wenn Sie eine Starttemperatur für eine PCR mit bekannten Forward- und Reverse-Tm-Werten planen.
Wenn Sie für eine Gradienten-PCR einen Bereich von ±3 °C um die berechnete Ta benötigen.
Wenn Sie die einfache Laborregel mit der Rychlik-Formel vergleichen möchten.
So funktioniert es
1Wählen Sie die Berechnungsregel: einfache Regel oder Rychlik-Formel.
2Geben Sie die Tm-Werte des Forward- und Reverse-Primers ein.
3Tragen Sie für die Rychlik-Berechnung zusätzlich die Produkt-Tm ein.
4Das Tool berechnet Ta, den Bereich von Ta − 3 °C bis Ta + 3 °C sowie Vergleichswerte zur jeweils anderen Regel.
Anwendungsfälle
PCR-Versuchsplanung anhand der Tm-Werte eines neuen Primerpaares.
Festlegung eines Temperaturbereichs für eine Gradienten-PCR.
Vergleich der einfachen Tm-minus-5-Regel mit einer Rychlik-Berechnung unter Einbezug der Produkt-Tm.
Beispiele
1. Standardpaar mit einfacher Ta von 55 °C
Laborant
Hintergrund
Für ein PCR-Experiment liegen ein Forward-Tm von 62 °C und ein Reverse-Tm von 60 °C vor. Die Tm-Differenz beträgt 2 °C.
Aufgabe
Eine geeignete Starttemperatur und ein Bereich für die Gradienten-PCR sollen bestimmt werden.
Verwendung
Wählen Sie die einfache Regel, geben Sie 62 °C und 60 °C ein und verwenden Sie eine Dezimalstelle.
Regel: Einfache Regel (Tm − 5 °C); Forward-Tm: 62 °C; Reverse-Tm: 60 °C; Produkt-Tm: 85 °C.
Ergebnis
Die empfohlene Ta beträgt 55 °C. Der Gradient reicht von 52 bis 58 °C. Die Tm-Differenz liegt innerhalb des empfohlenen Bereichs; der Rychlik-Vergleich ergibt 62,6 °C.
2. Rychlik-Berechnung mit Produkt-Tm von 85 °C
Molekularbiologe
Hintergrund
Dasselbe Primerpaar hat Tm-Werte von 62 °C und 60 °C. Für das erwartete PCR-Produkt wird eine Tm von 85 °C angesetzt.
Aufgabe
Die Annealing-Temperatur soll mit der Rychlik-Formel berechnet und als wärmere Alternative zur einfachen Regel geprüft werden.
Verwendung
FAQ
Welche Tm wird bei der einfachen Regel verwendet?
Es wird der kleinere Tm-Wert des Primerpaares verwendet. Davon werden 5 °C abgezogen.
Wie lautet die Rychlik-Formel?
Ta = 0,3 × Tm des Primers + 0,7 × Tm des Produkts − 14,9.
Was bedeutet der ausgegebene ±3-°C-Bereich?
Er beschreibt einen möglichen Gradientenbereich rund um die berechnete Annealing-Temperatur.
Welche Tm-Differenz zwischen den Primern ist empfehlenswert?
Die Tm-Werte sollten möglichst innerhalb von 2–3 °C liegen.
Was passiert bei einer zu niedrigen oder zu hohen Ta?
Eine zu niedrige Ta kann unspezifische Banden und Primerdimere begünstigen; eine zu hohe Ta kann zu keinem Produkt führen.