# 蛋白定量、酶动力学与序列分析工具

在一个实验室工作流中完成蛋白测定、浓度换算、序列分析，以及酶活性、动力学、抑制和结合测量解读。

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- **分类:** analyze-calculate

- **关键词:** 蛋白定量工具, BCA 蛋白测定, Bradford 蛋白测定, 酶动力学计算器, kcat 计算器, Ki IC50 计算器, 蛋白分子量, 蛋白等电点, 蛋白浓度换算, 比活性计算器

## 概述

这个主题覆盖蛋白实验室中从序列或肽段到定量和表征的常见路径：先估算分子量、组成、等电点和消光系数，再用 Bradford 或 BCA 读数定量样品，随后关联酶活性、比活性、kcat、Km、Ki、催化效率和结合亲和力。计算器会明确显示单位与假设，适用于实验规划、学习和结果核对。

## 工具

- 氨基酸组成分析器: 分析一条氨基酸序列的组成：20 种标准氨基酸各自的计数与摩尔百分数；分组统计（碱性 K/R/H、酸性 D/E、芳香族 F/W/Y、含硫 C/M、脂肪族 A/I/L/V、酰胺侧链 N/Q、羟基 S/T、其他 G/P）；按 Kyte–Doolittle 1982 疏水值计算 GRAVY 平均疏水指数（>0 偏疏水、<0 偏亲水，可溶性球状蛋白通常介于 −1 至 +0.3）；并附 ProtParam 平均质量表的分子量。歧义码（B/J/O/U/X/Z）单独计数、不计入百分比。来源：Kyte & Doolittle 1982、ExPASy ProtParam、Lehninger。仅供教学与实验规划。
- BCA 法蛋白定量计算器（标准曲线）: 按 BCA 法（二喹啉甲酸，562 nm）由标准曲线定量蛋白：粘贴“浓度(µg/mL), A562”标准品数据与待测孔吸光度，工具做最小二乘拟合（斜率、截距、R²），反算 c = (A−b)/m，乘以稀释倍数输出 µg/mL 与 mg/mL。超范围读数标记外推；低于空白的读数判不可定量。BCA 要点：兼容约 5% 去垢剂（裂解液首选，优于 Bradford）；但 DTT/TCEP/β-巯基乙醇（>1 mM）与高浓度 EDTA 会还原/螯合 Cu²⁺ 使读数虚高，须先除干扰；工作范围约 20–2000 µg/mL（Micro BCA 0.5–20）。来源：Smith 1985 Anal Biochem。仅供教学与实验规划。
- Bradford 法蛋白定量计算器（BSA 标准曲线）: 按 Bradford 法（考马斯亮蓝 G-250，595 nm）由 BSA 标准曲线定量蛋白：粘贴“浓度(µg/mL), A595”标准曲线数据与待测孔吸光度，工具做最小二乘拟合（给出斜率、截距、R²），反算 c = (A−b)/m，再乘以稀释倍数输出 µg/mL 与 mg/mL。超出标准范围的读数标记为外推；低于空白的读数判为不可定量。要点：染料响应随蛋白不同差异大（BSA 约为 IgG 的两倍），高去垢剂不适；配制标准品须与样品同缓冲液。来源：Bradford 1976 Anal Biochem。仅供教学与实验规划。
- 酶活力单位计算器（U，µmol/min）: 把原始测定数据换算为酶活力单位：1 U = 1 µmol/min（IUB 1978），1 U = 16.67 nkat。两种输入：产物生成量（µmol）÷ 时间（min）；或按 Beer–Lambert 从 ΔA/min、ε（mM⁻¹cm⁻¹，如 NADH 340 nm 处 6.22）、光程与反应体积计算 U = ΔA/min × V(mL) ÷ (ε×l)。附 mU/nkat/µkat 换算与吸光度线性窗口（0.05–1.0 AU）提示。来源：IUB 命名委员会、BIPM katal、Segel《Biochemical Calculations》。仅供教学与实验规划。
- 酶催化效率计算器（kcat/Km）: 计算催化效率 kcat/Km（M⁻¹s⁻¹）——低底物浓度下的表观二级速率常数，也是比较酶对不同底物偏好的公平标尺。两种输入：直接输入 kcat（s⁻¹ 或 min⁻¹）与 Km（nM/µM/mM）；或由 Vmax(µM/min) ÷ \[E\](µM) 先得 kcat 再除以 Km。判读（M⁻¹s⁻¹）：<10³ 低效（警惕底物错误或测定假象）、10³–10⁵ 一般、10⁵–10⁷ 高效（典型进化优化酶）、10⁷–10⁸ 很高、≥10⁸ 接近扩散控制极限（10⁸–10⁹）即“催化完美”（磷酸丙糖异构酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶）。仅在 Km ≫ \[E\] 的稳态假设下成立。来源：Fersht、Knowles & Albery 1977、Radzicka & Wolfenden 1995。仅供教学与实验规划。
- 酶抑制常数计算器（Ki 与 IC50，Cheng–Prusoff）: 在 IC50 与 Ki 之间按 Cheng–Prusoff 方程换算：竞争性 Ki = IC50 ÷ (1+\[S\]/Km)，反竞争性 Ki′ = IC50 ÷ (1+Km/\[S\])（结合 ES 复合物），纯非竞争性 Ki = IC50（与 \[S\] 无关）；亦可反向由 Ki 推 IC50。要点：IC50 不是常数——竞争性抑制剂的 IC50 随 \[S\] 升高，\[S\] = Km 时 Ki = IC50/2，报告 IC50 必须附 \[S\] 与 Km。Ki 判读（nM）：<1 极强、1–100 强（典型药物级抑制剂）、100–1000 中等、>1000 弱。假设：可逆平衡抑制、米氏动力学、非紧结合（紧结合需用 Morrison 方程），抑制机制应由多浓度拟合确证而非假设。来源：Cheng & Prusoff 1973、Copeland。仅供教学与实验规划。
- 酶动力学计算器（米氏方程）: 使用米氏方程 v = Vmax·\[S\]/(Km+\[S\]) 计算反应速率，或由 (S, v) 实验数据通过 Lineweaver-Burk 双倒数法估算 Km 和 Vmax，并模拟竞争性/非竞争性抑制。
- 酶转换数计算器（kcat）: 计算转换数 kcat = Vmax ÷ \[E\]总，单位 min⁻¹ 与 s⁻¹。三种输入：Vmax(µmol/min) ÷ 酶量(µmol)；Vmax(µM/min) ÷ 酶浓度(µM)；或由蛋白浓度(mg/mL)与分子量(kDa) 先得 \[E\](µM) = 1000×浓度÷MW（1 mg/mL 的 1 kDa 蛋白 = 1000 µM）再求 kcat。判读（s⁻¹）：<0.01 极慢、0.01–1 慢、1–100 中等（典型代谢酶）、100–10⁴ 快、>10⁴ 极快（过氧化氢酶 ≈4×10⁷ s⁻¹）。注意 \[E\] 需按活性位点计（n 聚体 × n）。来源：Michaelis-Menten 1913、Fersht、Lehninger。仅供教学与实验规划。
- 酶活力单位换算器（U ↔ katal）: 在酶活力单位制之间精确换算：1 U = 1 µmol/min（IUB 1978），1 kat = 1 mol/s（BIPM 1999），故 1 U = 16.667 nkat、1 µkat = 60 U、1 kat = 6×10⁷ U。输入 U/mU/µU 或 kat/mkat/µkat/nkat/pkat 中的任意一个数值，同时得到其余全部单位的等价活力。纯单位换算，不含测定假设，供论文报告与试剂说明书使用。来源：IUB 命名委员会、BIPM 第 21 届 CGPM、IUPAC 绿皮书。仅供教学与实验规划。
- 多肽分子量计算器（单同位素/平均）: 按残基求和计算多肽分子量：M = Σ 残基质量 + H₂O（ExPASy ProtParam 残基表）。支持单同位素（H₂O = 18.01056，适合高分辨质谱中的短肽）与平均（H₂O = 18.01524，适合较长肽链）两种模式，并同时给出 \[M+H\]⁺、\[M+Na\]⁺、\[M+2H\]²⁺ 离子 m/z。序列大小写不敏感，自动忽略空白与分隔符；歧义码 B/J/O/U/X/Z 会被拒绝。来源：ExPASy ProtParam（Gasteiger 2005）。仅供教学与实验规划。
- 蛋白浓度单位换算器（mg/mL ↔ µM ↔ %）: 蛋白浓度单位一站式换算：µM = mg/mL × 1000 ÷ MW(kDa)；1% (w/v) = 10 mg/mL = 1 g/L；1 µM = 1 pmol/µL。输入浓度并选择单位（mg/mL、µg/mL、g/L、% w/v、µM、nM、mM、pmol/µL）与分子量（kDa），同时输出全部 8 种单位。台架参考：BSA（66.4 kDa）10 mg/mL ≈ 151 µM；50 kDa 蛋白 100 µM = 5 mg/mL。来源：SI 词头与 % w/v 约定、Thermo Pierce 换算表、NEBioCalculator。仅供教学与实验规划。
- 蛋白-DNA 结合亲和力计算器（Kd 估算）: 按 1:1 结合平衡从单点数据估算 Kd：当蛋白过量时结合分数 f = \[P\]÷(\[P\]+Kd)，故 Kd = \[P\]×(1−f)÷f；f = 0.5 时 Kd 恰等于蛋白浓度。两种输入：直接输入结合分数（0–1），或由荧光各向异性 f = (r−r游离)÷(r结合−r游离) 换算。附带 ΔG° = RT·ln(Kd)（默认 25°C）。判读：<1 nM 极强、1–100 nM 强（典型转录因子/核酸酶靶点）、100 nM–1 µM 中等、>1 µM 弱（查盐浓度、poly(dI-dC) 竞争）。假设：平衡、1:1、蛋白远过量；完整滴定曲线应整体拟合。来源：Cantor & Schimmel、Heyduk & Lee 1990、Lakowicz。仅供教学与实验规划。
- 蛋白质消光系数计算器（ε280）: 按 Pace 1995 / Gill & von Hippel 1989 公式计算 ε280 = 5500×nTrp + 1490×nTyr + 125×n胱氨酸（M⁻¹cm⁻¹，典型误差 ±5%）。胱氨酸为二硫键配对的 Cys，仅氧化态计入（⌊Cys/2⌋，落单不计），工具同时给出全还原与全氧化两个值以便夹逼实际氧化态。序列模式自动计数 W/Y/C 并用 ProtParam 平均残基质量算分子量；计数模式直接输入残基数目与可选分子量。附带 A0.1% = ε/MW（1 mg/mL 的吸光度），即由 A280 反推浓度 c = A/ε。注意：不含 Trp/Tyr 的蛋白 ε280 近乎为零（改用 A205 或 BCA）；需扣除核酸污染（A260）。来源：Pace 1995、Gill & von Hippel 1989、ExPASy ProtParam。仅供教学与实验规划。
- 蛋白质等电点计算器（pI）: 按氨基酸组成计算理论等电点：对每个可解离基团用 Henderson–Hasselbalch 求净电荷（简化的 ExPASy/Bjellqvist pKa 集：N 端 7.5、K 10.0、R 12.0、H 5.98；C 端 3.55、D 4.05、E 4.45、C 9.0、Y 10.0），二分法求净电荷为零的 pH。同时给出生理 pH 7.4 净电荷、平均分子量（ProtParam 残基质量表 + 水）与酸性/碱性判读。局限：未折叠链的自由 pKa、不含翻译后修饰；所用参数集与二分算法和 Biopython IsoelectricPoint 完全一致（结果逐值相同），ExPASy 完整 Bjellqvist 表按末端残基区分 pK、可能略有差异。来源：Bjellqvist 1993、Gasteiger 2003（ExPASy）、Biopython IsoelectricPoint。仅供教学与实验规划。
- 蛋白质分子量计算器（按氨基酸序列）: 由氨基酸序列计算蛋白质分子量：MW = Σ平均残基质量 + H₂O（18.01524 Da），质量表与 ExPASy ProtParam 完全一致（A 71.0788 … W 186.2132）。输入大小写不敏感，自动忽略空白与 * - . 分隔符；歧义码（B/J/O/U/X/Z）不计入质量但会统计提示。结果为未修饰多肽链：不含信号肽切除、二硫键（每键 −2H）、翻译后修饰或标签。附 kDa、平均残基质量与链长。来源：ExPASy ProtParam（Gasteiger 2005）、Fasman 手册。仅供教学与实验规划。
- 酶比活力计算器（U/mg 蛋白）: 计算酶比活力 = 活力(U) ÷ 蛋白质量(mg)，或直接用活力浓度(U/mL) ÷ 蛋白浓度(mg/mL)。输出 U/mg、nkat/mg 与 µkat/mg。比活力是纯度指标：纯化过程中随之上升，纯酶上限 = kcat(min⁻¹) ÷ MW(kDa)（如 kcat 600 min⁻¹、60 kDa → 最高 10 U/mg），实测与理论值之比即纯度估计。要求活力与蛋白测定（Bradford/BCA/A280）均在线性范围内。来源：IUBMB 命名、Scopes《Protein Purification》、Lehninger。仅供教学与实验规划。

## 常见问题

### 这个主题覆盖哪些蛋白实验任务？

包含序列性质、肽和蛋白分子量、浓度换算、Bradford 与 BCA 标准曲线、酶活性和动力学、抑制剂效力、比活性以及蛋白-DNA 结合估算。

### 什么时候使用 Bradford、BCA 或 A280？

它们与样品基质的兼容性不同。Bradford 容易受蛋白组成和去污剂影响；BCA 通常更耐受去污剂，但会受还原剂影响；A280 依赖芳香族残基并需要校正核酸污染。应阅读工具中的注意事项并使用合适标准验证。

### 这些计算器可以替代实验方案吗？

不能。它们只根据输入值计算。可靠的实验结果仍需要合适的标准品、空白、重复、线性范围检查和方案特异性对照。

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